ВМІСТ АСКОРБІНОВОЇ, ДЕГІДРОАСКОРБІНОВОЇ, ДИКЕТОГУЛОНОВОЇ КИСЛОТ У ПРОРОСТКАХ СОНЯШНИКА ЗА ДІЇ ЙОНІВ СВИНЦЮ

Н. Воробець, І. Микієвич

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна,

e-mail biofr@franko.lviv.ua

 

Щороку полютанти, які надходять у навколишнє середовище, призводять до зниження продуктивності багатьох сільськогосподарських рослин. Одним із най­небезпечніших важких металів є свинець, оскільки відома його неґативна дія на організм людини [11]. Показано, що за дії високих, низьких температур, сильного освітлення, посухи а також дії повітряних полютантів, УФ-світла, гербіцидів у рослин виникає окиснювальний стрес, унаслідок якого відбувається надпродукція активних форм кисню (АФК) [14], які можуть неконтрольовано реагувати з білка­ми, ліпідами, нуклеїновими кислотами, порушуючи їх структуру [16, 14].

Рослини мають потужну систему антиоксидантного захисту, до складу якої входить аскорбінова кислота (АК) [1, 14, 18, 20]. АК присутня в усіх субклітинних компартментах рослинних клітин, включаючи апопласт, і має середню клітинну концентрацію 225 мМ [20]. Можливо, ця кількість є потрібним запасом “міцнос­ті” на випадок порушення системи регенерації аскорбату [4]. Показано, що за дії світла та за умов стресу концентрація аскорбату зростає [20]. АК – головний ком­понент у захисті рослини від вільних радикалів, Н2О2 та окиснювального стресу. Вона хімічно взаємодіє з АФК, тоді як аскорбатпероксидаза (субстратом якої є АК) каталізує специфічнну аскорбат-залежну детоксикацію Н2О2 у рослинних клітинах [18, 13].

Окиснення АК відбувається у два етапи. Першим продуктом, що утворюється при окисненні АК, є монодегідроаскорбат (MДA). MДA може бути відновлений до АК, або повністю окиснюватися до дегідроаскорбіновї кислоти (ДАК). ДАК може бути відновлена до АК, або піддаватися незворотній гідролітичній дециклізації, з утворенням 2,3-дикетогулонової кислоти (ДКГК) [10, 18, 21].

 


АК          Монодегідроаскорбат           ДАК                        2,3-ДКГК

Рис. 1. Схема окиснення АК

Соняшник є важливою сільськогосподарською культурою, яка широко куль­тивується в світі, зокрема в Україні. Попередніми нашими дослідженнями показа­но, що на ріст соняшника неґативно впливають високі концентрації свинцю в поживному розчині [2, 3]. Однак механізми дії йонів свинцю все ще залишаються не’ясованими. Тому метою цього дослідження було визначити вплив різних концентрацій ацетату свинцю на вміст АК, ДАК та ДКГК, порівняти співвід­ношення АК/ДАК у коренях та пагонах проростків соняшника – органах, які характеризуються різною інтенсивністю накопичення свинцю [3]. А також як впливає селеніт натрію у концентрації 10–8 М на ці показники.

Рослини соняшника Helianthus annus L. сорту Світоч стерилізували в слабко­му розчині KMnO4, розкладали на фільтрувальний папір, зволожений дистильо­ваною водою в емальовані кювети, пророщували при +24 °С у темноті. Через 3 до­би проростки пересаджували на водні розчини ацетату свинцю у концентраціях 10-3М, 105М, 108М, а також його комбінації із селенітом натрію у концентрації 10-8М та на моносольовий розчин селеніту натрію у концентрації 108М. Контролем служили рослини, вирощені на дистильованій воді (К1) та на розчині Кнопа (К2).

На 7, 12 добу від початку пророщування визначали в рослинах вміт АК, ДАК, ДКГК за методом [8]. Метод ґрунтується на взаємодії 2,4-динітофенілгідразину з ДАК та ДКГК з утворенням у середовищі сірчаної кислоти відповідних озазонів, які дають червоне забарвлення. Наважку рослинного матеріалу розтирали в 5% метафосфорній кислоті (1:10) [6]. Вміст АК, ДАК, ДКГК розраховували за різницею поглинання при 520 нм. Досліди тричі повторювали, одержані цифрові результати обробляли статистично [7].

У попередніх наших дослідженнях показано, що 108М концентрація ацетату свинцю не має неґативного впливу на ріст і розвиток рослин соняшника та квасолі, а наявність у поживному розчині 108 М селеніту натрію знижує поглинання рослинами йонів свинцю, позитивно впливає на проростання та ріст проростків [23]. Вищі концентрації ацетату свинцю в поживному розчині інгібують ростові процеси, сприяють накопиченню свинцю в коренях та пагонах рослин, призводять до їхньої загибелі. Експозиція впродовж 49 діб на розчинах ацетату свинцю дає змогу прослідкувати за змінами, які відбуваються у рослин, що майже повністю перейшли до автотрофного живлення, можливостями їх системи захисту.

Теперішні наші дослідження вмісту АК, ДАК та ДКГК у коренях та пагонах соняшника показують їх співвідношення за оптимальних для росту умов та залеж­ність цього показника від рівнів ацетату свинцю у середовищі вирощування.

Вміст АК у коренях контрольних (К-1) 7-ми рослин становив 10,8 мкг/г сирої маси, а в пагонах – 38 мкг/г сирої маси (рис. 25). При тривалій експозиції вміст АК у контрольних рослин, вирощених на воді, не змінився, а її вміст у пагонах подвоївся. У рослин К-2 вміст АК був подібний, хоча в пагонах 12-ти добових рослин він зростав лише в 1,5 раза. Вміст ДАК та ДКГК у коренях К-1 7-ми добових рослин був дещо вищим від вмісту АК та нижчим у пагонах і ця законо­мірність залишалась до 12 діб вирощування. Вирощування рослин на моносольо­вих розчинах ацетату свинцю та в комбінації з селенітом натрію призводили до значного зростання концентрації ДАК та ДКГК у коренях, а в 12-ти добових рос­лин і в пагонах. Особливо висока концентрація ДКГК була на 103 М ацетаті свин­цю та в комбінації із селенітом натрію.

Відомо, що в клітинах присутні всі три компоненти аскорбатної системи – АК, ДАК, ДКГК. За фізіологічних умов рівновага між ними сильно зсунута до АК, і цей стан характеризує резервні властивості антиоксидантної системи, її здатність у певних межах стабілізувати прооксидантно-антиоксидантну рівновагу, зв’язую­чи та інактивуючи АФК, органічні пероксиди [1]. Одержані нами дані свідчать, що антиоксидантні можливості в коренях і пагонах соняшника за дії 105 –103 М ацетату свинцю сильно порушені.

Рис. 2. Вміст АК, ДАК, ДКГК у коренях 7-добових рослин соняшника, мкг/г сирої маси. 1-Н2О; 2-р-н Кнопа, 3-10–3М Pb(СН3СОО)2; 4-10–5М Pb(СН3СОО)2; 5-10–8М Pb(СН3СОО)2; 6–10–3М Pb(СН3СОО)2, 10–8М Na2SeO3; 7 – 10–5М Pb(СН3СОО)2, 10–8М Na2SeO3; 8 – 10–8М Pb(СН3СОО)2, 10–8М Na2SeO3; 9 – 10–8М Na2SeO3

Рис. 3. Вміст АК, ДАК, ДКГК у пагонах 7-добових рослин соняшника, мкг/г сирої маси. Позначення як на рис. 2

Рис. 4. Вміст АК, ДАК, ДКГК у коренях 12-добових рослин соняшника, мкг/г сирої маси. Позначення як на рис. 2

Рис. 5. Вміст АК, ДАК, ДКГК у пагонах 12-добових рослин соняшника, мкг/г сирої маси. Позначення як на рис. 2

В огляді Вашко зі співавторами [21] наведено низку праць, у яких показано, що на рівні АК та ДАК впливає багато зовнішніх чинників, зокрема двовалентні катіони. В інших експериментах підтверджено, що підвищення ДАК у клітинах може призвести до інгібування ряду ферментів аскорбатного циклу [12]. Однак Морел зі співробітниками [17] доводять, що в хлоропластах ДАК не накопи­чується через високу активність монодегідро-аскорбатредуктази, а концентрація ДАК 50мкМ in vitro інгібує активність ряду хлоропластних пігментів. Високі рівні ДАК, виявлені нами при експозиції рослин соняшника на високих концентраціях ацетату свинцю, свідчать про непряме інгібування ним активностей ферментів відновлення аскорбату. Більше того, відбувається накопичення ДКГК, а це, як відомо [21], процес незворотній. Отже, накопичення в клітинах коренів та пагонів соняшника ДАК та ДКГК неґативно впливає на ріст органів і порушує в них антисвинцевий захист.

Співвідношення у клітині АК та ДАК важливий параметр її окисно-відновного статусу [9; 10].

У наших дослідженнях величина АК/ДАК залежала від вмісту свинцю у поживному розчині (таблиця).

Збільшення вмісту ДАК свідчить про посилення окислювальних процесів. У 7 добових рослин соняшника, вирощених на воді, співвідношення АК/ДАК стано­вило 0,55 ± 0,02, для 12 добових – 0,55 ± 0,03. Вирощування проростків на середовищі з різними концентраціями ацетату свинцю знижувало співвідношення АК/ДАК у коренях 7 добових рослин у середньому вдвічі порівняно з контролем К1 (табл. 1). Найнижчого значення цей показник досягнув у випадку 10–5М ацетату свинцю і становив 0,10 ± 0,01. Привертає увагу те, що в рослин, які ви­рощували на середовищі з найвищою концентрацією свинцю – 10–3М, співвідно­шення АК/ДАК становило 0,33 ± 0,02, однак за цих умов виявлено найвищу кількість дикетогулонової кислоти.

Можна припустити, що неґативний вплив високих концентрацій ацетату свинцю на рослини пов’язаний з тим, що утворена ДАК впливає на проходження фаз клітинного циклу. Подібну можливість показали інші дослідники [19; 15]. Вони пропонують АК на роль сиґналу, який разом із ДАК контролює проход­ження фаз клітинного циклу за умов зовнішнього стресу. Підтвердженням може бути нещодавнє відкриття транспортера ДАК у плазматичній мембрані вищих рослин, який сприяє проходженню в клітину апопластної ДАК [13]. Наші попе­редні дослідження показали в 1,81,9 разів зменшення значень мітотичного індекса клітин кореня соняшника при вирощуванні його на 10510–3 М ацетату свинцю, порушення розходження хромосом у анафазі [5].

Співвідношення АК/ДАК у рослин соняшника

 

Варіанти

7-добові

рослини

12-добові

рослини

корені

пагони

корені

пагони

Н2О (К1)

0,55±0,02

2,06±0,05

0,55±0,03

1,40±0,05

р-н Кнопа (К2)

0,82±0,04

0,72±0,03

0,81±0,02

1,47±0,04

10-8М Pb(СН3СОО)2

0,20±0,01

1,66±0,02

0,07±0,002

1,47±0,05

10-5М Pb(СН3СОО)2

0,10±0,01

1,68±0,04

0,40±0,02

1,43±0,05

10-3М Pb(СН3СОО)2

0,33±0,02

1,25±0,04

0,33±0,02

1,85±0,06

10-8М Pb(СН3СОО)2,

10-8М Na2SeO3

0,22±0,02

0,95±0,03

0,14±0,03

0,46±0,02

10-5М Pb(СН3СОО)2,

10-8М Na2SeO3

0,20±0,04

0,69±0,02

0,22±0,02

0,54±0,03

10-3М Pb(СН3СОО)2,

10-8М Na2SeO3

0,21±0,03

3,95±0,05

0,08±0,003

0,44±0,02

10-8М Na2SeO3

0,25±0,02

1,92±0,03

0,37±0,05

0,59±0,03

 

Зниження величини співвідношення АК/ДАК у коренях та пагонах пророст­ків соняшника може свідчити про зсув прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в бік процесів окиснення, індукованих іонами свинцю. А збільшення за цих умов вмісту ДКГК – продукту незворотного окиснення ДАК, вказує на вичерпання резервів аскорбінової кислоти – головного компонента системи антиоксидантного захисту рослин.

____________________

 

Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологи. Киев, 1997.

Воробець Н., Микієвич І. Сумісна дія свинцю і селену на проростання та ріст соняшника // Вісн. Львів. ун-ту Сер. біол. 2000. Вип. 26. С. 159165.

Воробець Н.М., Микієвич І.М, Романюк Н.Д., Терек О.І. Нагромадження свинцю рослинами соняшника та квасолі залежно від його вмісту в пожив­ному розчині // Наук. вісн. УжДУ. Сер. біол. 2000. 8. С. 6568.

Иванов Б.Н. Восстановление кислорода в хлоропластах и аскорбатный цикл // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 2. С. 165170.

Микієвич І.М., Воробець Н.М., Калинович Н.О. Локалізація свинцю у тканинах кореня соняшника і модифікація селеном його токсичної дії // Актуальні питання медицини, біології, ветеринарії і сільського госпо­дарства (в друці).

Окунцев и др. Спецпрактикум по биохимии и физиологии растений. Томск, 1981.

Плохинский Н.А. Биометрия. М., 1970.

Соколовский В.В., Лебедева Л.В., Лиэлуп Т.Б. О методе раздельного определения АК, ДАК и дикетогулоновой кислот в биологических тканях // Лаб. дело. 1974. 3. С. 160162.

Arrigoni O. Ascorbate system in plant development // J. of Bioenergetics and Biomembranes. 1994. Vol. 26. Is. 4. P. 407419.

De Gara, F. Tommasi. Ascorbate redox enzymes: A network of reactions involved in plant development // Recent Res. Devel. Phytochem. 1999. Vol.3. P. 115.

Gerber G.B., Leonard A., Jacquet P. Toxicity, mutagenicity and teratogenicity of lead // Mutation Reserch. 1980. Vol. 76. P. 115141.

Gupta M., Cuypers A., Vangronsveld J., Clijsters H. Copper affects the enzymes of the ascorbate-glutathione cycle and its related metabolites in the roots of Phaseolus vulgaris // Physiologia Plantarum. 1999. Vol. 106. N3. P. 262–267.

Horemans N, Foyer C. H. Asard H. Transport and action of ascorbate at the plant plasma membrane // Trends in plant science. 2000. Vol. 5. N6. Р. 153158.

Inze D., Van Montagu M. Oxidative stress in plants // Current Opinion in Biotech­nology. 1995. Vol. 6. P. 153158.

Kato N, Esaka M. Expansion of transgenic tobacco protoplasts expressing pumpkin ascorbate oxidase is more rapid than that of wild-type protoplasts // Planta. 2000. Vol. 210. P.10181022.

Morel Y, Barouki R. Repression of gene expression by oxidative stress // Biochem. J. 1999. Vol. 342. P. 481496.

Morell S., Follmann H., De Tullio M., Häberleim I. Dehydroascorbate and dehydro­ascorbate reductase are phantom indicators of oxidative stress in plants // FEBS Lett. 1997. Vol. 414. N3. P. 567570.

Noctor G, Foyer C. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 1998. Vol. 49. P. 249279.

Potters G., Horemans N., Cauberg R.J., Asard H. Ascorbate and dehydroascor­bate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension // Plant Physiol. 2000. Vol. 124. N1. P. 17–20.

Smifnoff N. Ascorbic acid: metabolism and functions of a multi-facetted molecule // Curr. Opin. in Plant Biol. 2000. Vol.3. P. 229235.

Washko P.W. Ascorbic acid and dehydroascorbic acid analyses in biological samples // Anal. Biochem. 1992. Vol. 204. N1. P. 114.